Банковские реквизиты

КГКУ «Краевая ветеринарная лаборатория»
ИНН 2465083660 КПП 246501001
660020, г. Красноярск, ул. Дудинская 5г
Отделение Красноярск г. Красноярск
УФК по Красноярскому краю (КГКУ "Краевая ветеринарная лаборатория" л/с 04192019690)
БИК 040407001 р/с. 40101810600000010001
ОКПО 74864650
ОГРН 1042402649453
ОКВЭД 85.20 74.30.2
тел./факс: (391) 220-12-87
тел./ИЦ: (391) 220-12-84
тел./лаборатории (391) 220-12-86
тел. бухгалтерии: (391) 220-13-35

Авторизация



Диагностика отравлений собак изониазидом в ветеринарных лабораториях

КГКУ «Краевая ветеринарная лаборатория», Красноярск

Дроздова Т.С.

 

Актуальность темы. Данный вид исследования достаточно актуален, в связи с тем, что уже несколько лет бродячих и декоративных собак травят лекарством от туберкулеза, под названием «Тубазид». (Изониазид (тубазид) — лекарственное средство, противотуберкулезный препарат (ПТП), производное гидразида изоникотиновой кислоты (ГИНК). Показан для лечения туберкулёза всех форм локализации. Химическая формула: C6H7N3O)

Изониазид используется для лечения актиномикоза крупного рогатого скота, однако для лечения мясо-молочного скота употребление препарата не разрешено. Препарат не эффективен для лечения хронического гранулематозного энтерита крупного рогатого скота. Препарат высокотоксичен для собак (LD50 50 мг/кг живого веса) и кошек, одна таблетка 300 мг способна причинить смертельно опасное отравление центральной нервной системы собаки. Грызуны же относительно устойчивы к токсическому действию изониазида. Наиболее частые случаи отравления связаны со случайным приёмом одной таблетки препарата.

 

Данное исследование актуально также при проведении химико-токсикологического анализа, когда в патологическом материала групповая реакция на алкалоиды дает положительный результат.

В химико-токсикологическом отделе Красноярской Краевой ветеринарной лаборатории проходил случай отравления собаки данным препаратом.

Из анамнеза: кобель цвергшнауцер, 8 мес вернулся с прогулки и через 15-20 минут появились признаки болезни: сильная рвота, судороги, гиперсаливация, непроизвольная дефекация и мочеотделение. Владелец собаки обратился в ветеринарную клинику, где было проведена дезинтоксикационная и симптоматическая терапия (реланиум, магния сульфат, дексаметазон и лазикс). Однако несмотря на лечение смерть животного наступила в течении часа.

После смерти собака была доставлена в ветеринарную лабораторию для установления причин смерти.

При вскрытии наблюдалась следующая картина: слизистая оболочка желудка отечна, печень в объеме увеличена, слизистая гортани отёчная, покрыта точечными кровоизлияниями, кровь плохо свернувшаяся, полнокровие внутренних органов, резкое полнокровие и отек головного мозга, мелкие кровоизлияния в вещество головного мозга, признаки ишемии миокарда, множественные кровоизлияния на слизистой оболочке желудка и кишечника.

Для исследования был отобран патологический материл: часть печени, желудок с содержимым, почка.

Исследования проводились по общетоксикологическим показателям. При анализе на алкалоиды была получена положительная реакция с групповым реактивом Драгендорфа. Это послужило отправной точкой для исследования на изониазид (тубазид).

Самый простой (химический способ)- обнаружения изониазида (точнее, всех производных гидразид изоникотиновой кислоты)  ) - реакция с водным раствором ванадата аммония (концентрация 1-2%) - желто-коричневое окрашивание, в течение 5-10 минут значительно бледнеющее.

Необходимо сказать, что групповая реакция с реактивом Драгендорфа не является специфической, подобную реакцию могут дать и другие лекарственные препараты (но-шпа, папаверин), поэтому вопрос о идентификации препарата достаточно актуален.

Мочу исследовали напрямую, из крови предварительно получали сыворотку (осадив белки трихлоруксусной кислотой, отцентрифугировав и нейтрализовав щелочью); таким же образом подготавливали содержимое желудка.

Для идентификации можно использовать метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах «Сорбфил» или «Силуфол». В методиках рекомендуется использовать систему, состоящую из хлороформа, ацетона, дионилового эфира фталевой кислоты (5:4:1), однако на практике, последний реактив обычно отсутствует, поэтому в ряде случаев можно обойтись без него. В этом случае, предпочтительно использовать систему хлороформ-ацетон (9:1), при слабом разделении, можно увеличить количество ацетона. На пластину наносили растворенный хлороформенный экстракт и рядом стандарт. Общее количество нанесенного образца составляет в среднем 0,02мл. Ориентироваться на величин Rf не стоит, так как эта величина рассчитана на чистые вещества. Стандарт готовили путем растворения лекарственного препарата в подщелоченном хлороформе. Анализ проводили обязательно со свидетелем. Проявляющим реактивом является реактив Драгендорфа, который проявляет препарат в виде красно кирпичных пятен.

Также мы использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, который оказался незаменимым для идентификации и количественного определения изониазида. Для хроматографического анализа мы использовали изолированную сухую щелочную вытяжку (методика определения алкалоидов в патологическом материале) с рн 9, затем проводили растворение пробы в ацетонитриле с последующим детектированием и измерением содержания изониазида. Использование высокоэффективного микроколоночного жидкостного хроматографа "Милихром А-02"  явилось идеальным методом для определения данного препарата. Процесс анализа пробы делится на 2 этапа: разделение пробы на составляющие компоненты,  детектирование и измерение содержания вещества. Результаты, полученные нами при использовании ВЭЖХ, являются существенно более точными, к основным рассматриваемым характеристикам – чувствительность и селективность, добавляются экспрессность и экономичность данного метода.

Результаты полученные на приборе "Милихром А-02" представлены на рисунке 1.

Рис. 1. Хроматограмма выделения изониазида из содержимого желудка

 

Для подтверждения был использован метод внутреннего стандарта результаты которого представлены на рисунке 2. На хроматограмме видно, что произошел прирост пика «изониазид», что является подтверждением присутствия данного токсиканта в пробе.

Рис. 2 Увеличение пика «изониазид» при использовании метода «внутреннего стандарта»

Заключение:

 

Процесс идентификации отравляющих веществ в частности изониазида целесообразно разделить на два методических этапа. Первый, скрининговый (указательный) — в данном случае качественная реакция с реактивом Драгендорфа и тонкослойная хроматография в присутствии свидетеля. Данный метод обладает высокой производительностью, высоким уровнем чувствительности, достаточно широким охватом классов токсичных соединений, но не обладает высокой специфичностью. На этом этапе можно получить минимум отрицательных ответов и максимум положительных, однако при таком методологическом подходе число ложноположительных результатов значительно.

Второй этап- удаление всех (в идеале) ложноположительных результатов. В данном случае — высокоэффективная жидкостная хроматографию с использованием внутреннего стандарта позволяет уменьшить число ложноположительных результатов. На ряду с чувствительностью и селективностью этот метод обладает экспрессностью и экономичностью.

 

Список литературы:

 

    1. Антонов Б.И., Федотова В.И., Сухая Н.А. Лабораторные исследования в ветеринарии //химико-токсикологические методы/ Москва: Агропромиздат-1989.-С.244-248

    2. В Донецке ежегодно с особой жестокостью мэрия убиват тысячи собак // Новости Донбасса. — Донецк

    3. Изониазид. Cправочник лекарств РЛС: инструкция, применение и описание вещества Изониазид

    4. Куцева Екатерина Нет зоофашизму!. Донецкий Коммуникационный Ресурс (23.04.2010). Проверено 12 декабря 2010.

    5.Лазарева Елена Более 200 укушенных — это не предел? // Дружковка на ладонях : газета. — Дружковка: 2010-04-20.

    6. Непрерывные способы гидролиза цианопиридинов в адиабатических условиях-Патент 2175968

    7. Перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных средств. Распоряжение Правительства Российской Федерации от 30 декабря 2009 г. N 2135-р

    8. Смирнова  Елена. Численность бродячих собак в донецкой области будут контролировать противотуберкулезными таблетками // «Факты и комментарии» : газета. — 20.03.2003.

    9. Стрелис А.К., Фомина И.П., Дехнич А.В. Противотуберкулезные химиопрепараты // Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии / Страчунский Л.С., Белоусов Ю.Б., Козлов С.Н.. — 2-е. — Смоленск: НИИ антимикробной химиотерапии СГМА, 2002. — С. 65-75. — 586 с.

    10. Lorrie Boldrick Top 10 Human Medications That Poison Our Pets  (англ.). — ASPCA. копия документа

    11. Steeve Giguère, John F. Prescott, J. Desmond Baggot Isoniazid // Antimicrobial therapy in veterinary medicine. — 4, illustrated, revised. — Wiley-Blackwell, 2006. — P. 297. — 626 p. — ISBN 0813806569 (англ.)

    12. Meyer H, Mally J (1912). «On hydrazine derivatives of pyridine carbonic acids» (German). Monatshefte Chemie verwandte Teile anderer Wissenschaften 33: 393–414.

    13. T. P. Sycheva, T. N. Pavlova and M. N. Shchukina (1972). «Synthesis of isoniazid from 4-cyanopyridine». Pharmaceutical Chemistry Journal 6 (11): 696–698. DOI:10.1007/BF00771896.

    14. Villar D, Knight MK, Holding J, Barret GH, Buck WB. Treatment of acute isoniazid overdose in dogs. (англ.) // Veterinary & Human Toxicology. — 1995 Oct. — В. 37(5):473-7.. — ISSN 0145-6296.